猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞增殖和凋亡影响的研究
周清安1，余海滨2
（1.南京中医药大学级博士研究生，江苏南京；2.河南中医学院第一附属医药中心实验室，河南郑州）
摘要：
目的：探讨猫爪草皂苷（Radixranunculusternatesaponins，RRTS）对人结肠癌LoVo细胞增殖和凋亡的作用及其机制。
方法：按猫爪草皂苷浓度分为1、10、、μg/mL4个处理组和对照组（未加猫爪草皂苷），处理LoVo细胞不同时间后，倒置显微镜观察细胞形态；采用MTT法检测细胞增殖的抑制情况；荧光染色观察细胞凋亡；流式细胞仪（FCM）进行细胞周期分析；采用细胞免疫化学检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的变化。
结果：与对照组比较，猫爪草皂苷可使细胞明显变圆、体积缩小、脱壁细胞增多；MTT法检测显示，猫爪草皂苷处理组随着浓度的增加和作用时间延长，LoVo细胞增殖的抑制作用增强，并呈时间、剂量依赖性（P0.）；荧光显微镜下部分细胞发生凋亡形态学改变，对照组和4个猫爪草皂苷不同浓度处理组凋亡率分别为（3.57±1.56）%、（8.14±1.02）%、（11.11±2.30）%、（17.59±0.95）%和（25.10±1.23）%；流式细胞术显示，G1期细胞增加，而停滞在S、G2期细胞减少；细胞免疫化学检测发现，经猫爪草皂苷作用24h后，LoVo细胞Bax蛋白水平明显增高，而Bcl-2出现抑制，Bcl-2/Bax比例下降，Caspase-3蛋白水平明显升高，且呈明显的浓度依赖性。
结论：猫爪草皂苷具有明显抑制人结肠癌LoVo细胞增殖和诱导凋亡作用，下调Bcl-2、Bcl-2/Bax，增加Bax、Caspase-3蛋白的表达可能是其作用机制之一。
关键词：猫爪草皂苷；结肠癌LoVo细胞；细胞增殖；细胞凋亡；Bax；Bcl-2；Caspase-3
中图分类号：R.5
文献标识码：A
文章编号：-X()04--03
猫爪草系毛茛科植物小毛茛（RanunculusternatusThunb）的块根，性平，味甘、辛，归肝、肺经。有解毒、化痰散结之功能，临床上用于治疗肺结核、颈淋巴结核、咽喉炎、淋巴癌、甲状腺肿瘤及乳腺肿瘤等疾病。王爱武[1]博士发现猫爪草皂苷对肉瘤S、艾氏腹水瘤EAC及人乳腺癌MCF27细胞的生长和集落形成均有不同程度的影响，皂苷给药量与抑瘤率和集落形成明显地呈正相关。早期研究报道，猫爪草Cu/Zn值趋向与癌症患者Cu/Zn值相反[2]，猫爪草有效成分对肿瘤坏死因子有诱生作用[3]。基于此，本研究观察猫爪草皂苷对结肠癌LoVo细胞体外增殖和凋亡的影响，并进一步探讨作用机制。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞
人结肠癌细胞株LoVo购于中南大学湘雅中心实验室。
1.1.2药物和主要试剂
猫爪草皂苷为河南医院中心实验室提供；罗丹明（Rhodaminel23）荧光探针，Sigma公司。
1.1.3主要仪器
倒置显微镜，日本Olympus公司；全自动酶标仪，奥地利；流式细胞仪，Coulter，U.S.A.；激光共聚焦系统，德国Leica公司。
1.2方法
1.2.1猫爪草皂苷作用的观察
①细胞毒性测定（MTT法）：用含10%胎牛血清的RPMI液调细胞浓度为1×/孔，接种于96孔板，过夜培养，次日实验组加入不同浓度的皂苷，其终浓度分别为1、10、和μg·L-1，对照组只加等量的PBS液，每组设6平行孔，将培养板置于5%CO2、37℃培养箱中，继续培养24、48和72h，在额定时间将每孔加入MTT20μL，继续培养4h，吸去上清液，加入DMSO（μL/孔），混匀10min后，在酶标仪上测定各孔nm处的吸光度A值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）×%。
②流式细胞仪（FCM）测定细胞周期和调亡率：不同浓度皂苷处理LoVo细胞，同时设阴性对照组，于24h后PBS洗涤后收集细胞，加入预冷的乙醇（浓度为70%），于4℃固定24h，离心洗涤后，悬浮于PI染液中，最后以目筛网过滤，调整细胞浓度为1×·mL-1，流式细胞仪分析，激发光源为氩离子激光，激发波长nm，用MulticycleDNA分析软件行细胞周期的测定。
1.2.2激光共聚焦扫描技术观察线粒体膜电位的变化
细胞的处理：取对数生长期LoVo细胞，经消化、吹散、重悬于10%小牛血清RPMI培养液中，调整细胞浓度为5×cell·L-1。加入内置盖玻片（多聚赖氨酸浸泡，晾干）的6孔培养板内，（2.5mL，培养24h后分别在不同时段加入含皂苷（μg·L-1）小牛血清10%的RPMI培养液中，于4h、8h、12h等时相点终止培养进行观察，另设不加入皂苷的为对照。罗丹明荧光探针标记：皂苷对细胞作用不同时间后，Rho10μg·mL-1染色，在37℃，5％CO2培养箱温育15min，PBS洗3次。用激光共聚焦观察线粒体膜电位的变化:每组选择不同视野的单个细胞，用激光共聚焦显微镜的图像分析系统（TCS-Tool）分析整个胞内的荧光强度（膜电位变化以荧光强度表示），统计不同作用时间细胞的荧光值，计算Δψm的变化。1.3统计学方法
用SPSS10.0统计软件包，进行F检验。
2
2、结果
2.1细胞形态学观察结果
倒置显微镜下观察，经皂苷处理12和24h后，部分细胞贴壁脱落，悬浮于培养液中，细胞变圆，体积减小，核固缩，核颜色加深，折光性增强，其中μg·mL-1皂苷作用24h最明显，细胞数少，脱壁细胞明显增多。对照组细胞贴壁生长，细胞呈多角形，胞质饱满，生长舒展，相邻细胞生长融合成片。
2.2猫爪草皂苷对LoVo细胞的抑制用
不同浓度皂苷作用24、48、72h后，LoVo细胞的生长均不同程度地受到抑制，并呈浓度和时间依赖性特点，其中以μg·mL-1皂苷在72h时抑制率为最高。皂苷处理组LoVo细胞生长抑制率与对照组比较，差异均有显著性（P0.），见表1。
2.3流式细胞仪定量分析
与对照组相比，24h后各组随着药物浓度的增加，G1期细胞数量增多，S期、G2期细胞下降，见表2。凋亡率分别为7.1%、13.7%、18.0%和27.4%，差异显著（P0.）。细胞凋亡峰越来越明显，见图1。
2.4激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位的变化
μg·mL-1皂苷作用4h细胞荧光含量（.55±7.68）显著减弱，8h为（.16±9.30），12h后细胞的线粒体膜电位强度进一步下降（92.97±11.44)。各组与对照组（.26±12.58）差异显著（p＜0.05）。
3、讨论
肿瘤细胞无限增殖是肿瘤发生发展的主要原因。如长春花碱、紫杉醇、三尖杉碱、喜树碱等常用抗肿瘤药物，作用于肿瘤细胞生长的不同阶段，使细胞生长所需要的DNA、RNA、蛋白质合成受到严重障碍，从而使肿瘤细胞停止于增殖周期的某一时相，或作用于肿瘤细胞能量代谢的某一环节，导致肿瘤细胞呼吸链受阻死亡，或破坏细胞膜引起细胞自溶死亡。本观察显示，猫爪草皂苷可组滞结肠癌LoVo细胞于S、G2期，以致癌细胞不能顺利进入下一周期，并有量效正相关系。大量实验证实，许多因素诱导的细胞凋亡都存在线粒体功能紊乱，并认为它的出现时导致细胞不可逆亡的关键环节。在肿瘤细胞凋亡早期，线粒体首先出现形态改变，同时它参与细胞呼吸、氧的代谢、酶活性和能量供应。这些功能与线粒体膜的通透性即跨膜电位差（Δψm）密切相关。线粒体以一种独特的方式调控着与细胞凋亡有关的因子Bcl-2/Bax，钙离子等。线粒体释放这些因子可抑制或促进细胞凋亡，因此，被认为是凋亡调节中心[5]。
线粒体在进行电子的呼吸链传递时，将质子从线粒体的内膜基质侧泵到内膜外，而内膜不允许质子回流，因此造成膜内外的电化学梯度，这里既有H+浓度梯度，又有跨膜电位差。正是这种跨膜电位在维持线粒体膜的完整性和功能方面起重要的作用。本实验皂苷作用LoVo细胞后短时间内（4h）可诱导线粒体改变，和Johnson等用地塞米松引起淋巴细胞线粒体变化的时间相近[6]。说明线粒体数量变化或转膜电位改变，其反应速度很快。随着皂苷作用时间的延长，显示的荧光强度逐渐减弱，表明细胞跨膜电位强度不断下降，而电位下降会严重影响线粒体的功能，细胞内线粒体中呼吸链的代谢紊乱直至中断，破坏线粒体膜的完整性，发生细胞凋亡。
猫爪草胶囊
猫爪草。
本品为胶囊剂，内容物为棕褐色光滑小丸粒；气微，味微酸。
散结，消肿。用于瘰疬，淋巴结核未溃者，亦可用于肺结核。
每粒装0.53g。
口服，一次4-6粒，一日3次，黄酒送服。连服六日，隔三日后再服。老人及儿童酌减。（儿童用快接健冲温开水送服，3至4岁一次1粒，5至8岁一次2粒，9至12岁一次3粒，每日3次；女士避开经期。）
尚不明确。
尚不明确。
乳腺增生，子宫肌瘤，前列腺炎、增生、肥大，甲状腺结节，囊肿，淋巴结肿大，肿瘤，结核，宫颈糜烂，糖尿病，顽固性牙痛，偏头痛，肝病等。
◆参考文献
[1]王爱武，王梅，袁久荣，等.猫爪草提取物体外抗肿瘤作用的研究[J].天然产物研究与开发，，16(6)：-.
[2]全山丛，汪学昭，郑汉臣，等.中药猫爪草的微量元素分析[J].微量元素与健康研究，，14(2)：29-30.
[3]周立，张炜，许津.猫爪草有效成分诱生肿瘤坏死因子的作用[J].中国医学科学院学报，，17(6)：-.
[4]ScarlettJL,SheardPW,HughesG,etal.Changesinmitochondrialmembranepotentialduringstaurosporine-inducedapoptosisinJurkatcells[J].FEBSLett,，：-.
[5]罗非君，胡智，曹亚，等.茶多酚诱导鼻咽癌细胞cyclinDI表达下调[J].癌症，2，20(4)：-.
[6]JohnsonLV，WalshML，BockusBJ，etal.Monitoringofrelativemitochondrialmembranepotentialinlivingcellsbyfluorescencemicroscopy[J].CellBiol，，88：-.
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